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基因工程中限制酶切割的几个问题 张玉林

作者: 来源: 发布时间:2012年07月04日 点击数: 字体: 大 小

基因工程中限制酶切割的几个问题

张玉林

摘要  在高中生物教材中,基因工程相关内容的介绍相对简单,在教学过程中,教师和学生常常对基因工程中限制酶切割的有关知识点存在疑问。为了便于教师开展教学活动,笔者针对限制酶的功能、特点对教师教学过程存在的疑问进行了辨析,以为教学提供参考。

关键词  基因工程  限制酶  酶切图谱

限制酶全称限制性核酸内切酶,能识别并切割具有特异序列的双链DNA分子,主要从原核细胞中分离纯化而来,迄今为止,已分离出来的限制酶越有4000余种。作为基因工程中非常重要的一种工具,它应用广泛,是历年高考中能力题的命题着力点,但由于书本相关内容介绍简单,而命题常有所拓展,因此很多师生在解答此类题目时常发生认知冲突,产生很大的困惑,为此,笔者总结了教学过程中的一些问题,供大家参考。

1  限制酶能将外来的DNA切断,使之失去活力,为什么对自己的DNA却无损害作用?

在人教版《生物·必修2·遗传与进化》中,关于“T2噬菌体侵染细菌”的实验就已经告诉我们,原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵,这一点学生很容易理解并接受,但对于原核生物细胞内的限制酶只切割外源DNA,而不切割自身DNA,却难以理解。

在长期的进化过程中原核生物形成了一套完善的防御机制,以保持自身遗传的相对稳定性。当外源DNA侵入后,限制酶就将其切割掉,使外源DNA不能发挥遗传效应,但限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在,它们具有相同的底物专一性,具有识别相同碱基序列能力。甲基化酶的甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸,甲基受体为DNA上的腺嘌呤与胞嘧啶。当限制酶作用位点上的某一些碱基被甲基化修饰后,限制酶就不能再降解这种DNA了,所以限制性内切酶只降解外源入侵的异种DNA,而不分解自身DNA,在消解外源DNA遗传干扰的同时又保护了自身遗传特性的稳定。

2  一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列吗?

    在人教版《生物·必修2·遗传与进化》P102中,明确指出:“一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNA分子”,但真实情况却并非如此,有少数限制性核酸内切酶可以识别两种以上的核苷酸序列。如HindⅡ的识别序列为5’…GTPy ↓PuAC…3’,其中Py=C或T;Pu=A或G。这样HindⅡ的识别序列实际为四种。如图1:

 

 

3  不同种类的限制酶识别的核苷酸序列一定不同吗?切割位点一定不同吗?

有一些限制酶虽然来源不同,但识别的是同样的核苷酸序列,这类酶称为同裂酶,而同裂酶的切点位置可能相同也可能不同。如图2和图3:

 

 

4  如果不同种类的限制酶分别识别不同的核苷酸序列,是否一定产生不同的黏性末端?

有些限制酶虽然来源各异,识别的靶序列也不相同,但切割双链DNA后却可以产生相同的黏性末端,这一类限制酶称为同尾酶。如图4:

 

值得注意的是,BamHⅠ和BglⅡ切割DNA后虽然产生了相同的黏性末端,但如果这样的黏性末端相结合,将不能再被BamHⅠ或BglⅡ识别并切割。

5  构建酶切图谱时,如何确定限制酶切点的位置?

人们为了了解基因的结构,通常选取某一特定长度的DNA分子,用多种限制酶单独或联合切割,再通过电泳技术将酶切片段进行分离,计算相对大小以确定每一种限制酶在DNA分子中的切点位置和相对距离,即构建酶切图谱,一般以直线或环状图式表示。酶切图谱的构建在DNA序列分析、基因文库的构建等工作中具有重要意义,近年来也成为高考的热点。那究竟如何构建呢?笔者以一道高考题为例加以说明。

【例题】 (2011江苏高考)用限制酶EcoRV、MboⅠ单独或联合切割同一种质粒,得到的DNA片段长度如下图(1 kb即1000个碱基对),请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。

 

【分析】第一步:首先明确被切割的DNA分子是环状还是线状,以确定各限制酶切割位点的数目。如本题中的质粒为环状双链DNA分子,一次切割只能产生一个片段,故EcoRV切点数目为1,MboⅠ切点数目为2。

第二步:从单酶切的最大片段入手,将单酶切片段与双酶切片段逐一比较,绘制酶切图谱。如图MboⅠ切割后产生一个大片段11.5kb与双酶切产生的5.5kb和6kb重叠,确定EcoRV的切点位置在11.5kb中。

【答案】

 

 

【变式训练】  限制酶能识别特定的DNA序列并进行剪切,不同的限制酶可以对不同的核酸序列进行剪切。现以2种不同的限制酶对一5000bp大小的线状DNA 进行剪切,相关实验如下,请根据表中数据,绘制相应限制性酶的酶切图谱。

表1 

已知一线性DNA序列共有5000bp(bp为碱基对)

第一步水解

产物

(单位bp)

第二步水解

产物

(单位bp)

A酶切割

2100

将第一步水解产物分离后,分别用B酶切割

1900   200

1400

800    600

1000

1000

500

500

B酶切割

2500

将第一步水解产物分离后,分别用A酶切割

1900   600

1300

800    500

1200

1000   200

经A酶和B酶同时切割

1900    1000    800    600    500    200

【分析】首先确定为线状DNA分子,由单酶切的片段数可知A酶与B酶的切割位点分别为3个和2个,具体分析步骤如下图:

 

【答案】

 

 


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